液相色譜儀原理
【儀器原理】液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送（zui高輸送壓力可達4.9′107Pa）；色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行
連續檢測。
【液相色譜儀特點】1．高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350*105Pa 。
2．高速：流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少于1h 。
3．：近年來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。
4．高靈敏度：液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。
5．適應范圍寬：氣相色譜法與液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難于應用氣相色譜法進行分析。而液相色譜法只要求試樣能制成溶液，而不需要汽化，因此不受試樣揮發性的限制。對于高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大于400 以上）的有機物（這些物質幾乎占有機物總數的 75% ～ 80%）原則上都可應用液相色譜法來進行分離、分析。據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70% ～80% 。
【液相色譜儀各個系統的組成和特點是什么？】
液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面將分別敘述其各自的組成與特點。
1．進樣系統
一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。
2．輸液系統
該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47～4.4×107Pa，流速可調且
穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存器和梯度儀可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、pH 值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。
3．分離系統
該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內徑為2 ～5mm ，由不銹鋼、厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，柱內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）。固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性、多孔性和比表面積大的特點，加之其表面經過機械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。
因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態，極易降低渦流擴散效應?；|粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度越小，塔板理論數N 就越大，這也進一步證明了基質粒度小，會提高分辨率的道理。
此外，液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調到60℃，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
4．檢測系統
液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
（1）紫外檢測器
該檢測器適用于對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點是，使用面廣（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）、靈敏度高（檢測下限為10-10g/ml）、線性范圍寬、對溫度和流速變化不敏感、可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
（2）示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7g/ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用于痕量分析，也不適用于梯度洗脫樣品的檢測。
（3）熒光檢測器
凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用于具有熒光的有機化合物（如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14g/ml），痕量分析和梯度洗脫樣品的檢測均可采用。
（5）數據處理系統
該系統可對測試數據進行采集、貯存、顯示、打印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。
上述介紹的內容是通用儀器的原理，各液相色譜儀的具體操作要求，需使用者仔細閱讀儀器說明書。